Denis Podalydès fait ses débuts à la Comédie-Française en 1997 en interprétant Mikhaïl Alexandrovitch Rakitine dans Un mois à la campagne d’Ivan Tourgueniev mis en scène par Andreï Smimoff. En 2000, il devient le 505e sociétaire de la Troupe et reçoit le Molière de la Révélation théâtrale pour son rôle dans Le Révizor de Gogol par Jean-Louis Benoit. De nombreux metteurs en scène de renom le sollicitent dans des registres très différents. Également metteur en scène, il monte à la Comédie-Française Fantasio de Musset, Ce que j’appelle oubli de Laurent Mauvignier, Cyrano de Bergerac d’Edmond Rostand – le spectacle est récompensé de six Molière dont celui du meilleur metteur en scène et du meilleur spectacle de théâtre public –, Lucrèce Borgia de Victor Hugo et Les Fourberies de Scapin de Molière. Hors Comédie-Française, il met en scène plusieurs textes d’Emmanuel Bourdieu comme Tout mon possible, Je crois ? Le Mental de l’équipe, L’homme qui se hait. En 2012, il monte Le Bourgeois gentilhomme de Molière au Théâtre des Bouffes du Nord, où il présente également, en 2014, Les Méfaits du tabac de Tchekhov entre autres.
Parallèlement, Denis Podalydès participe à une centaine de films. Il a coécrit et joué dans la plupart des films de son frère Bruno dont Versailles-Rive gauche, Dieu seul me voit, Liberté-Oléron, Adieu Berthe. Il a tourné entre autres avec Arnaud Desplechin dans Comment je me suis disputé (ma vie sexuelle), Ducastel et Martineau dans Jeanne et le garçon formidable, Diane Kurys dans Les Enfants du siècle, Sagan et Pour une femme.
Officier dans l’ordre des Arts et des Lettres, il a également publié des ouvrages dont Voix off (Mercure de France, 2008, Prix Fémina Essai), Scènes de la vie d’acteur (Seuil, 2006) et La Peur, Matamore (Seuil, 2010).